抽提酵母菌DNA

以下介紹以Zymolase處理yeasts, 使成為spheroplasts, 再以SDS使破裂, 再以potassium acetate將SDS, proteins及cellular debris沉淀, 而核酸則保留在上清液中, 這種方法來抽提yeast的DNA.

材    料：

YPD medium

Sorbitol solution

0.3mg/ml Zymolase (20,000U/g) in sorbitol solution

0.28M β-mercaptoethanol

Tris/EDTA solution

10﹪SDS

5M Potassium acetate

100﹪ethanol

TE buffer

1mg/ml RNase A

100﹪isopropanol

15ml 離心管(用過即棄式)

30℃及37℃振盪培養(yǎng)相

65℃水溶器

方    法：

1.     在15ml無菌離心管中, 培養(yǎng)5ml的純yeast菌種(由單一菌群接種),  30℃, 振盪培養(yǎng)24hr, 350rpm, 此時細胞數(shù)約1~2×108cells/ml.

2.     離心3,000rpm, 5min, 將上清液吸除.

3.     加入0.5ml sobitol solution, 充分溷合.

4.     加入5μl的0.3mg/ml zymolase in sobitol solution, 以及50μl的0.28M β-mercaptoethanol, 充分溷合(votex), 置37℃, 1hr, 振盪200rpm.

5.     離心3,000rpm, 5min, 吸除上清, 加入0.5ml Tris/EDTA液, 將液體吸上吸下以充分溷合, 再將全部液體(即細胞浮懸液)轉入1.5ml的微量離心管中.

6.     再加入50μl的10﹪SDS液, 緩緩溷合, 置65℃, 20min.

7.     再加入200μl的5M potassion acetate, 緩緩溷合, 置冰上30min.

8.     離心10,000rpm, 3min.

9.     將上清液轉入另一離心管中, 再加入100﹪ethanol置離心管, 緩緩溷合. (此時DNA會出現(xiàn))

10.離心10,000rpm, 10sec, 沉淀DNA, 倒除上清, 將DNA溶于300μl TE中.

11.加入50μl的1mg/ml Rnase A, 充分溷合, 置37℃, 1hr.

12.加入0.5ml的100﹪isopropanol, 緩緩溷合, 至DNA沉淀出來.

13.將DNA以微量吸管尖頭取出, 并轉入另一新離心管中, 加入125μl的TE buffer.

配方：

Sorbitol solution：

0.9M sorbitol

0.1M Tris,Cl, pH8.0

0.1M EDTA

Tris/EDTA solution：

50mM Tris,Cl, pH8.0

20mM EDTA

附注：

在抽提yeast DNA時, plasmids也會一同析出, 其量大約是yeast DNA量的1/1,000, 亦即在2ml的yeast cells可提出約4μg的DNA, 而其中plasmids約有4ng, 可直接用來轉植. (只要用0.1μg的DNA即可, 其中約含0.1ng的plasmeds)