酵母菌基因轉(zhuǎn)植

目前將基因轉(zhuǎn)植入yeast中, 主要有電子槍, 電極, lithium acetate及spheroplasts等法, 此處僅介紹lithium acetate法. 此法是基于陽離子可使yeast的細胞膜能使DNA透過, 在加入DNA后, 再加入polyethylene glycol(PEG), 再涂在選擇性的培養(yǎng)皿上.

材    料：

YPD medium

TE buffer

Lithium autate solution

5mg/ml carrier DNA (sheared E.Coli DNA)

PEG solution

含選擇性化學品的培養(yǎng)皿

方    法：

1.     將純化的單一菌群yeast加入2ml YPD液中, 在30℃成長一晚.

2.     將細胞稀釋至OD600＝0.2(約3×106cells/ml)取50ml YPD(含上述量之yeast)于250錐形瓶中使長4hr, 30℃, 使達OD600＝0.5~1.0(約1~2×107cells/ml), (使用時約10ml可做一個實驗).

3.     將細胞轉(zhuǎn)入無菌離心管, 離心2,500rpm, 10min, 倒去上清, 將細胞溶在10ml的lithium acetate液中.

4.     再離心2,500rpm, 10min, 倒去上清, μl的lithium acetate液中.

5.     將細胞符懸液轉(zhuǎn)入一支消毒過的13×100ml試管置30℃, 輕輕振盪50rpm, 1hr.

6.     將100μl的上述細胞浮懸液加入微量離心管中(一共可有5支), 除控制組那支外, 其馀各加入10μg的Donor DNA及20μg的carrier DNA(�？傮w積不要多于15μl). 對控制組則只加入carrier DNA, 將液體以pipettor上下抽吸溷合. 置30℃, 30min.

7.     每支試管加入0.7ml PEG液, 以手指輕彈試管溷合之, 置30℃, 45min, 再置42℃, 5min.

1.     將每試管內(nèi)吸出200μl涂選擇性平盤, 置30℃, 2天, 可看結(jié)果.

2.     將再選擇性平盤上的分離菌種, 取數(shù)個, 分別培養(yǎng)于培養(yǎng)液中, 以便保存.

配方：

lithium acetate solution：

0.1M lithium acetate

10mM Tris.Cl, pH8.0

1mM EDTA

以過濾消毒

PEG solution：

40﹪(w/v) PEG3350

0.1M lithium acetate

10mM Tris Cl, pH8.0

1mM EDTA

過濾消毒

附注：

此種方法可得約每μg DNA, 有1~10個細胞可轉(zhuǎn)植成功.