Yeast的嫁接媒介

有些yeast的嫁接媒介(cloning vector)為plasmids, 稱為YRP(yeast replicating plasmids), 其中含有yeast DNA複製起始點(diǎn)的片段基因, 稱為ARS(autonomous replication sequences), 但這種plasmids在繁殖過(guò)程中常不能保存在新的細(xì)胞中, 若在此plasmids中加入Centromeres(CEN elements), 而形成YCP(yeast centromeric plasmids), 就可使其穩(wěn)定性增加.

另有YEP(yeast episomal plasmids), 是由yeast的plasmid所構(gòu)成. 還有YLP(yeast linear plasmids)是直線型的, 因含有telomeres, 還有yeast artificial chromosome(p YAC), 可供嫁接約400Kb的DNA. 此plasemid并可長(zhǎng)在E.Coli中.

在這些嫁接媒體中, 為便于檢測(cè)特定基因的功能, 常在此特定基因加上Lac 2 gene, 此基因係因E.Coli中得來(lái), 會(huì)產(chǎn)生β-galactosidase, 當(dāng)此  遇到一些類似β-galactosides物時(shí), 會(huì)分解之而產(chǎn)生有顏色的分解物, 很容易偵測(cè). 為使此基因能在yeast中運(yùn)作, 在此基因前需先加上yeast的promoter region, 以下介紹一種測(cè)β-galactosidase量的方法.

此法是基于含此基因的yeast, 長(zhǎng)于培養(yǎng)液中, 加入ONPG(O-nitrophenyl-β-D-galactoside), 使在30℃作用, 再以滴定使pH達(dá)11終止反應(yīng), 再以光譜儀測(cè)色度變化而計(jì)算β-galactosidase的量.

材    料：

YPD培養(yǎng)液

Z buffer

0.1﹪sodium dodecyl sulfate (SDS)

chloroform

4mg/ml ONPG in 0.1M KPO4, pH7.0 (過(guò)濾消毒, 保存-20℃)

1M NaCO3

30℃ Water bath

方    法：

1.     以一個(gè)菌群的純yeast接種于5ml的YPS液中, 過(guò)夜(可做二, 三個(gè)菌群以便比較).

2.     以過(guò)夜培養(yǎng)的yeast液50μl接種無(wú)菌的YPD液5ml, 使長(zhǎng)至OD＝2.0(大約0.5~1×108cells/ml).

3.     離心2,500rpm, 5min, (桌上型離心機(jī)), 將沉淀物溶于等量Z buffer中. (如果β-galactosidase量不多, 可以溶于較少量的Z buffer中).

4.     由上述步驟中之yeast, 取出二個(gè)樣本, 一為100μl細(xì)胞加900μl Z buffer, 另一為50μl細(xì)胞加950μl Z buffer.

5.     在每一樣本中各加入1滴Chloroform及2滴0.1﹪SDS液, vortex 10sec, 再放入30℃水浴中15min.

6.     在每一樣本中加入0.2ml的4mg/ml ONPG, vortex 5sec, 并于30℃水浴中, 并開始計(jì)時(shí).

7.     發(fā)現(xiàn)有黃色出現(xiàn)時(shí), 加入0.5ml的1M Na2CO3并記下時(shí)間.

8.     離心5min, 2,500rpm, 在測(cè)上清液的OD420與OD550(若上清液中不含細(xì)胞破裂物, 則OD550通常為0, 可以不計(jì)算).