南方式雜交(Southern Boltting and Hybridization)

DNA片斷經(jīng)電泳后, 再將雙股分離為單股, 然后將此單股DNA轉(zhuǎn)移至nylon膜上, 經(jīng)過前處理程序, 以避免雜質(zhì)影響結(jié)果, 再將具有螢光標(biāo)志的DNA探針與此單股DNA雜交, 之后將未結(jié)合的多馀單股DNA洗去, 再將nylon膜放入X光片卡夾中, 待曝光完全后, 將X光片沖出, 以檢視結(jié)果.

材料：

欲檢測(cè)之DNA(10μg左右)

電泳設(shè)備

DNA marker

直尺

0.2N HCl

nylon膜

Denaturation solution

[配方]1公升dH2O中含87.75g NaCl, 20.0g NaOH保存于室溫

Naturation Solution

[配方]1.5M NaCl, 0.5M Tris.Cl pH7.2, 0.001M EDTA

20X SSC

[配方]每公升含175g NaCl, 88g Na3.Citrate.2H2O以1M HCl將pH調(diào)整至7.0

透明塑膠膜

Vaccum blotter

大張濾紙

0.4M NaOH液

SDS/Prohybridization solution

[配方]每500ml中含：

12.5ml之1M KPO4, pH7.4

125m之20X SSC

25ml之100X Denhardt`s solution

-配方-每500ml中含：

10g Ficoll 400

10g Polyvinylpyrrolidone

10g BSA保存在-20℃

或以30g脫脂牛奶粉溶于500ml dH2O中取代

5ml之5mg/ml salmon sperm DNA

250ml之100﹪formamide

82.5ml之dH2O

再加入1﹪(w/v)之SDS保存在-20℃

SDS/hybridization solution

[配方]與SDS/Prehybridization solution相似, 除不加水外, 加入50g的dxtran sulfate<分子量500,000>, 然后攪拌整夜, 第二天在水使整個(gè)體積成為500ml, 保存在-20℃.

紫外線DNA定合儀

封袋機(jī)

塑膠袋

以螢光標(biāo)定之探針DNA(此一部份之製作另外說明)

X光片

X光片卡夾

暗房設(shè)備(裝X光片及沖片用)

方法：

1. 先將欲檢測(cè)之DNA及DNA marker依一般電泳技術(shù)執(zhí)行電泳.

2. 將電泳膠取出照相(在拍照時(shí)一把直尺放在泳膠旁, 以確定各DNA片段之位置以便比較分子量).

3. 將電泳膠放入依含500ml 0.2N HCl的盤中, 緩緩搖動(dòng)此盤10min.

4. 倒去HCl液, 加入dH2O清洗泳膠三次. 此時(shí)loading dye中的bromphenol blue由藍(lán)變黃, 倒去dH2O.

5. 倒入500ml denaturation solution, 緩緩搖動(dòng)盤子, 15min后, 倒去液體再重複一次, 此時(shí)bromphenol blue顏色又恢復(fù)為藍(lán)色, 顯示DNA雙股以分離為單股, 倒去液體.

6. 加入500ml denaturation solution, 搖動(dòng)盤子30分鐘.

7. 以利剪剪下一塊比泳膠各邊均小3mm之nylon膜, 至一盤中含20X SSC液, 液量已能遮蓋此膜為度, 5min(處理nylon膜時(shí)必須戴手套操作, 以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 因此膜極為敏感).

8. 另剪一張濾紙與nylon膜同大小, 亦浸入20X SSC液中.

9. 依Vaccum blotter裝置將nylon膜放在濾紙上, 再放在多孔盤上, 再放在blotter主體凹凸?fàn)钇奖P上, 在nylon膜上則放上軟塑膠墊片, 此墊片之上放泳膠, 有孔的面向上, 泳膠底繳邊均比此墊片之切割面要大至少5mm, 再蓋上blotter的蓋框.(若泳膠與nylon膜之間有任何氣泡存在, 可以玻璃吸管平平推過泳膠面, 使氣泡推出, 至完全無氣泡為止).

10.打開抽器開關(guān), 調(diào)整吸力至5 inches水銀柱高.

11.在blotter蓋框中倒入1,500ml之0.4M NaOH液, 檢查泳膠與墊片之接合是否緊密；并檢查真空吸力是否維持5 inches Hg, 做必要之調(diào)整.

12.讓DNA游泳膠中轉(zhuǎn)移至nylon膜上, 90分鐘, 關(guān)掉開關(guān).

13.將裝置鬆開, 取出泳膠, 在紫外線下檢查是否有無DNA存留.(必要時(shí)可再以1.0μg/ml濃度的ethidium bromide染色一次在檢查).

14.將nylon膜取出,放在2X SSC中2分鐘再取出, 此時(shí)以鉛筆在nylon膜上做記號(hào)以辨認(rèn)有DNA的面.

15.將nylon膜以透明膠膜包好, 有DNA的面向上, 至于紫外線DNA定合儀中照射120,000micro joules, 5min紫外線, 此時(shí)DNA已定合在膜上, 取出nylon膜.

16.將nylon膜放入封閉的塑膠袋中, 并在袋中加入10ml SDS/Prehybridization液, 至65℃, 1hr后, 剪開袋角一小口, 倒出液體.

17.將準(zhǔn)備好的帶螢光之DNA探針放小型離心管中, 在沸水中置5分鐘, 再將之加入10ml之SDS/hybridization液中, 充分溷合, 再注入袋中, 再將袋角封口, 置65℃, 過夜.

18.第二天, 將袋剪開, 取出nylon膜,

先以  2X SSC/0.1﹪SDS洗 5min, 室溫；

再以  2X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室溫；

再以0.5X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室溫；

再以0.1X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室溫；

再以0.1X SSC/0.1﹪SDS洗30min, 65℃.

19.將nylon膜由包膜中取出, 在暗房中將nylon膜與X光片放入X光片夾中, 2天, 有DNA的面與X光片相向.

20.在暗房中, 取出X光片, 沖出, 檢視結(jié)果.

在正常情況下, 在10μg的哺乳類DNA中, 可偵測(cè)出10pq(1pq＝0.1×10-12g)的DNA, 亦即一個(gè)基因的量即可測(cè)出, 因此本實(shí)驗(yàn)可比為由大�？蓳漆�.

此實(shí)驗(yàn)中, 若所欲找的基因與探針之間的差異較大, 則雜交溫度可降低些. 在雜交液中所使用的dextran sulfate目的在促使探針DNA結(jié)合于雜交處, 但對(duì)單股DNA無用, 故不必用于前處理液中.