DNA連鎖合成反應(yīng)

PCR是應(yīng)用一種由高溫生存細(xì)菌的DNA合成酶, Taq DNA Polymerase, 加上Primers及dNTPs, 再能控制溫度循環(huán)的合成儀中, 先加熱使原本之DNA由雙股分成單股, 再降溫至Primers可與單股DNA結(jié)合, 再升溫至DNA合成酶能充分運作, 一段時間后, 又升溫使DNA分為單股, 再降溫使Primers結(jié)合,再升一點溫使DNA合成酶能充分運作, 如此不斷循環(huán), 約20~30次之后, DNA就可將特定片段倍複製達數(shù)百萬次, 如此用以偵測微量DNA或測DNA中有無特殊排序等, 應(yīng)用十分廣泛.

材料：

10X及1X PCR reaction buffer

8mM dNTP mix

Oligonucleotide PCR Primers (上行與下行二股)

DNA模子

5μ/μl Termus aquaticus DNA Polymerase (Taq Polymerase)

Mineral oil

a thermal cycler

方法： 

1. 在微量離心管中加入：

10μl 10X PCR reaction buffer

10μl 8mM dNTP mix solution

10μl 10μM 上行(Upstream) PCR Primer

10μl 10μM 下行(Downstream) PCR Primer

59μL template DNA(1μg in nuclease free dH2O)

1μl Taq Polymerase(2.5μ/μl)

若體積因各項成分的濃度之故未達100μl 可以1X PCR buffer調(diào)整.

2. 加入100μl mineral oil(防止蒸發(fā))

3. 設(shè)定thermal cycler, 使先加熱至94℃, 使DNA分成單股, 2min.

4. 在設(shè)定DNA復(fù)合溫度, 此溫度隨Primer之組成而不同. 大致可以下列經(jīng)驗公式推估：

 Tm＝81.5＋16.6(logM)＋0.41(GC﹪)－(500/n)

其中n＝Primer的長度

M是緩沖液中的鹽分濃度摩爾數(shù)(不計Mg++的濃度)

例如, NaCl濃度為0.04, Tris濃度為0.67, 則為：

   0.04(NaCl)＋0.67×0.01(Tris)＝0.047M salt

若以25個bp的Primer而言, 其Tm為

   Tm＝81.5＋16.6(log0.047)＋0.41(60)－(500/25)＝64

而通常復(fù)合溫度為Tm＋22度＝66度. 但若一時未便估算, 則以55℃進行, 一般也可成功.

進行一分鐘.

5. 再設(shè)定DNA合成溫度75℃, 2min. 在2分鐘時間, DNA至少可合成1,000bp.

6. 如此設(shè)定thermal cycler循環(huán)3~5過程3次.

7. 取出10μl(取在mineral oil下層液體部分), 以電泳檢試結(jié)果.

以下將各有關(guān)材料參考資料列出供不時之需(一般均係向廠商直接採購時索取或調(diào)好者, 此處為若需自行調(diào)配時參考用)

＊8mM dNTP：將2mM之每種(共4種)dNTP溷入, 保存在-20℃.

＊Oligonucleotide PCR Primers：以dH2O調(diào)成10Um, 保存在-20℃.

＊10X PCR buffer：50mM KCl  100mM Tris.Cl, pH8.4

  15mM MgCl2200μg/ml gelatin

＊Taq DNA polymerase：通常以5μ/μl濃度出售, 而使用時每100μl, 只要1.5~2.5μ即足, 故在使用前可以PCR buffer調(diào)整濃度. 此酶無proof reading功能, 亦未明顯發(fā)現(xiàn)有exonuclease的功能. 最適宜的反應(yīng)溫度為75~80℃.

＊在PCR反應(yīng)中, 下列條件必須注意：

1. 至少要有2μTaq polymerase/100μl reaction

2. 1.5mM之Mg+2/0.8mM dNTP mix

3. 100 Pmol each Oligonucleotide PCR Primers