觀察Clostridium tetani(破傷風(fēng)桿菌)和Clostridiumsporogenes經(jīng)過Spore stain后所呈現(xiàn)的形狀。

實驗材料：薄抹片、malachite green(5%)、火焰、Safranin、顯微鏡油鏡。

實驗方法：Wirtz-Conklin method如下：

制作薄抹片，加入malachite green(5%)。

用火焰在其下慢慢輕輕地?zé)�，見其產(chǎn)生白煙，稍微移開后再燒。如此持續(xù)5min.，促使孢子上色。

背面沖水后，將水甩掉。

用Safranin(番紅)做背景染色30sec.。

背面沖水后，在空氣中待其乾燥。

用顯微鏡油鏡鏡檢。　

實驗結(jié)果：孢子的地方染上綠色后即不易脫色，其他地方則呈現(xiàn)背景顏色(紅色)�！�

Clostridium tetani(破傷風(fēng)桿菌)形成terminal spore，狀似鼓棒(drum stick)。Spore處是綠色，桿狀處是紅色。

Clostridium sporogenes猶如糖果狀，中央孢子處是綠色，兩旁是紅色�！�

實驗討論：

　　Clostridium tetani (破傷風(fēng)桿菌)除了可以用鏡檢外還可用體外隔離，不過這兩種方法都不是很成功。

Clostridium sporogenes和Clostridium tetani一樣在鏡檢下也不是很成功，通常是因為孢子不易染色的關(guān)系。　

　　Clostridium tetani和Clostridium sporogenes都是厭氣菌，為了作為實驗材料而培養(yǎng)時，用豬肝、豬肝湯再經(jīng)高溫、

高壓滅菌作為medium的效果很好(可能是因為養(yǎng)分充足，有g(shù)lutathione，作用類似cystine、arginine為還原劑，可將O2鎖住的關(guān)系)。

　　Clostridium tetani可以從臨床上來診斷，病人通常有傷口、牙關(guān)緊閉(由于三叉神經(jīng)運動分支障礙，導(dǎo)致咀嚼肌強直，病人的嘴不由自主地緊閉，稱為trismus或lockjaw)、且曾有免疫缺失的情況。若直接從傷口取出Clostridium來做抹片染色的材料，并不能確認(rèn)一定是C. tetani。所以取出后可以直接在blood agar或轉(zhuǎn)移到cooked meat medium(加熱800C，10~15min.以破壞非孢子物)。在blood agar經(jīng)過24小時的培養(yǎng)后，將發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)聚集的情況(因為C. tetani是有運動性的)。　

　　經(jīng)過Spore stain后，將發(fā)現(xiàn)猶如網(wǎng)球拍狀的terminal spores�！�

　　進一步的確認(rèn)是藉由偵測它的neurotoxin產(chǎn)物。方法是從C. tetani的純培養(yǎng)液中抽取濾液并注射到老鼠腿中，另一只則多加了tetanus antitoxin。幾個小時后，未受保護的老鼠腿部出現(xiàn)僵硬和肌肉痙攣并延伸到尾部，然后到另一條腿上。受保護的老鼠則倖免于難。　

　　Clostridium sporogenes是一種非致病性的細(xì)菌。它通常和Clostridium perfringens (Welch's bacillus)，Clostridium novyi，和Clostridium septicum等細(xì)菌一起存在。它們?nèi)缤�腐生菌般存在于土壤和人及動物的腸道。當(dāng)傷口接觸到被糞便汙染的土壤，感染就發(fā)生了。大部分絕對厭氧、產(chǎn)毒、可形成孢子的G(+)細(xì)菌便會感染傷口而造成一種致命的疾病，我們稱為Gas gangrene(氣性壞疽)或Clostridial myonecrosis、Clostridial myositis。有75%與Cl. perfringens相關(guān)，1/3是以Cl. perfringens為致病原。