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細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸系統(tǒng)實驗步驟之細胞轉(zhuǎn)染！

信息分類：生命科學(xué)資訊　　　　作者:YIYI發(fā)布　

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細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸系統(tǒng)實驗步驟之細胞轉(zhuǎn)染！
細胞轉(zhuǎn)染（transfection）暨蛋白質(zhì)外釋作用：VSVG-GFP與ARLI-QL質(zhì)體（plasmid）共同轉(zhuǎn)染
1. 取4×104個COS-7細胞至12-well plate的單一培養(yǎng)井（well）中，經(jīng)隔夜培養(yǎng)約16~24小時。
2. 取100μl OPTI-MEN（ㄧ種不含胎牛血清的培養(yǎng)液）及0.5μg ARL1QL質(zhì)體、0.5μg VSVG-GFP質(zhì)體混合，取100μl OPTI-MEN 及1μl lipofectamin（ㄧ種脂小體）混合，將二者均勻混合，靜置30分鐘。
3. 取出原培養(yǎng)液，并加入100μl OPTI-MEN至每一個培養(yǎng)井后，將含有ARL1QL、VSVG-GFP及脂小體的混合液加入培養(yǎng)井，放入二氧化碳培養(yǎng)箱5小時。
4. 抽出混合液，更換正常之培養(yǎng)液（含10% FBS(胎牛血清)/DMEM），繼續(xù)培養(yǎng)36-48小時。
5. 取出細胞培養(yǎng)盤后，以 PBS 清洗一次，再以濃度4 % 的福馬林進行固定15分鐘。
6. 以PBS清洗一次，加入含有0.01 % Triton X-100、0.05 % SDS的清潔劑，靜置15分鐘，以增加細胞膜的通透性。
7. 以PBS清洗二次，加入含有saponin、BSA的阻斷緩衝液，靜置30分鐘，以阻斷抗原與抗體間非專一性的結(jié)合。
8. 取出阻斷緩衝液后，加入抗ARL1的抗體（來自兔子的多株抗體；一級抗體），靜置30分鐘。
9. 以 PBS 清洗四次，加入含有螢光標(biāo)定的二級抗體（抗兔子之免疫球蛋白，來自山羊；紅光），以及 DNA 染劑 Hochest33258，靜置30分鐘。
10. 以PBS清洗四次，待自然風(fēng)乾后，于載玻片上滴入封片液，進行封片。
11. 以螢光顯微鏡觀察標(biāo)示蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的分布情形。
本文由出自上海光學(xué)儀器廠，轉(zhuǎn)載請注明
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