有多種從組織培養(yǎng)細胞中分離粗微體的方法,
所以這里描述一種方法中每一步的必要條件,并提示特殊環(huán)境下的做法,
以便該方法能夠根據(jù)實驗?zāi)康膩磉M行修改
為了確保制備的成功,應(yīng)該考慮到幾個一般性問題:
細胞的預(yù)處理粗微體制備的原理是基于粗微體的浮力密度,
而浮力密度受到單位面積微體膜中含有的核糖體的數(shù)目的影響,
所以最好防止在多聚核糖體洗滌步驟中
由于慢慢冷卻導(dǎo)致的多聚核糖休的解離而引起浮力密度的改變
由于蛋白質(zhì)合成的起始階段比延伸階段對低溫更敏感,在低溫時延伸步驟。
可以繼續(xù)而起始步驟停止,從而使多聚核糖體解離成為單體或亞單位
為此,細胞收獲前5一10分鐘往培養(yǎng)基中加人環(huán)己酰亞胺(終濃度大約為10μmOL/L ),
同時細胞用含有同樣濃度的環(huán)己酰胺洗滌這一預(yù)處理對收集懸浮細胞尤其重要,
因為冷卻培養(yǎng)基需要一定時間.