最全面的顯微鏡細胞消化法（傳代培養(yǎng)）操作指南
一. 事前準備：
1.使用顯微鏡前用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
2.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。
3.正確擺放使用的器械，保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4.點燃酒精燈，注意火焰不能太小。
5.準備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。
6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。
7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞，注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭光學(xué)顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。
8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。
9稍微搖搖，然后從對側(cè)倒掉培養(yǎng)液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精燈。
二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。
2. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度，然后讓其停止消化。
3.倒掉消化液加入培養(yǎng)液，棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液。注意要在對測加入培養(yǎng)液。
三.吹打分散細胞：
1.吹打制懸：在顯微鏡用吸管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。
2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。
4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。
四.分裝稀釋細胞：
1.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml，最后要做好標記。
五.傳代培養(yǎng)：
用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。
六傳代細胞培養(yǎng)注意事項：
1.嚴格的無菌操作
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
附：0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)
配方：100ml PBS,0.25g胰酶
步驟：
1先配100mlPBS。
2 稱胰酶0.25g。
3 加入PBS中，低速攪拌。
4 調(diào)PH7.4。
5 過濾，分裝，-20℃保存，4℃短期內(nèi)用完。
注意：低速很重要，機械攪拌對酶是一種沖擊，如果起沫，酶就變性了。低溫，防止酶失活；對難消化的細胞，在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)