腸病毒 71 型 (EV 71, 2272 strain) 培養(yǎng)
先以含 10% FBS-MEMα medium 于 15 cm 培養(yǎng)盤，并使之長成約 7~8
分滿，吸除舊的培養(yǎng)液，再加入含 2% FBS-MEMα medium，并接種入 15 µl
EV 71，置于 5% CO2 之 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約 3 天后，連同培養(yǎng)液吸入 50 ml
離心管，以 3000 rpm 離心 10 分鐘，吸取 1 ml 上清液分裝，保存于-70℃冰
箱，以待測定每 1 ml 病毒液的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50/ml)。

四、半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infection dose, TCID50)
先將 RD cell 以 2 x 104
cell/well 培養(yǎng)至 96 well plate，將待測病毒先經(jīng)
由 10 倍序列稀釋后，加入 50 µl 稀釋過的病毒液于 96 well plate，10
-3
~ 10
-10
(三重覆)，放入 5% CO2 之 37℃培養(yǎng)箱，3 天后取出 96 well plate，觀察是否
有細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE)產(chǎn)生，并將之記錄下來分別計(jì)算每 1 ml
病毒液有多少 TCID50。

五、FACScan 分析
將 RD cell 以 3 x 105
cell/well 培養(yǎng)至 6 well plate，放入 5% CO2 之 37℃
培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)，吸掉舊培養(yǎng)基，添加不同濃度之穿心蓮乙酸乙酯萃取物(50
~ 10 µg/ml)、純化合物 1 ~ 12 (10 ~ 2.5 µg/ml)與 RD cell 預(yù)培養(yǎng) 2 小時，再
添加由 TCID50 實(shí)驗(yàn)求得之 EV 71 病毒液，共同培養(yǎng) 48 小時后，以顯微靜
觀察 CPE 情形，并拍照記錄之。
加入適量 trypsin 處理細(xì)胞，使其由 6 well plate 培養(yǎng)皿表面脫落，再添
加適量 2% FBS-MEMα medium 終止 trypsin 反應(yīng)，以 3000 rpm 離心 5 分鐘，
吸去上清液，加入 1 x PBS buffer，3000 rpm 離心 5 分鐘，吸去上清液，加
入 methanol 于 4℃反應(yīng) 30 分鐘，3000 rpm 離心 5 分鐘，吸去上清液，加入
1 x PBS buffer，3000 rpm 離心 5 分鐘，吸去上清液，加入 RNAase A 于室溫
下反應(yīng) 10 分鐘，再加入 PI (Propidium iodide, Sigma)，于冰上避光反應(yīng) 15
分鐘，以流式細(xì)胞儀 (FACScan, BD)收集細(xì)胞，并以 CellQuest 軟體分析數(shù)
據(jù)