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PAP包埋前染色的操作步驟和PAP法包埋后染色

信息分類：生命科學(xué)資訊　　　　作者:YIYI發(fā)布　

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PAP包埋前染色的操作步驟和PAP法包埋后染色

    PAP法常用包埋前染色，現(xiàn)以超氧化物歧化酶為例，說明具體
的操作步驟。
    (l)固定組織恒冷箱冰凍切片10um用于光鏡，振動(dòng)切片或手切
薄片等用于電鏡。
    (2)切片經(jīng)PBS(pH7.4)漂洗。
    (3)0.3%H2O2甲醇溶液室溫10-30min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。
    (4)0.25%tritonX一100處理10min。
    (5)正常羊血清(1:30 PBS稀釋)室溫30min。，吸干。
    (6)第一抗體(免抗SOD血清，l:2000)4℃濕盒中48-72h。
    (7)0.lmol/L PBS漂洗(3X5min)。
    (8)羊抗免一lgG(l:30-50)室溫30-60min。
    (9)0.lmol/PBS漂洗(3X5min)。
    (10)免PAP復(fù)合物(1:100)室溫30-60min。一抗、二抗和PAP的合
適稀釋度要通過預(yù)試驗(yàn)來確定。
    (11)0.lmol/L PBS漂洗(3X5min)
    (12)用含0.05%二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和0.01%H2O2的混
合液(用0.05mol/LTris-HCI緩沖液PH7.4配制)室溫15min。顯
色。鏡下控制反應(yīng)強(qiáng)度，適時(shí)終止顯色。
    (13)0.lmol/L PBS漂洗(3X5min)，光鏡觀察。
    (14)電鏡研究時(shí)，用4%戊二醛再固定60min，PBS漂洗、解
剖鏡下檢出免疫陽性部位.修整切片，用1%鋨酸后固定30-
6Omin.若用1.5%亞鐵氰化鉀一l%鋨酸后固定，這樣可不進(jìn)行電
子染色，直接電鏡包埋、切片和觀察。
    (15)對照:①用正常兔血清代抗S0D血清作對照:②不加
抗SOD血清的空白對照;③吸附試驗(yàn)，用SOD吸附抗SOD血清。
以上三種對照均為陰性。
    PAP法包埋后染色
    (l)固定組織按常規(guī)電鏡包埋、切片。
    (2)將載有切片的鎳網(wǎng)在5%的H2O2液中刻蝕2-3min。，生
理鹽水沖洗，濾紙吸干。其余操作步驟同PAP包埋前染色法的
(3)-(14)步同。
本文由出自上海光學(xué)儀器廠，轉(zhuǎn)載請注明
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