體視顯微鏡下毛囊干細(xì)胞組織塊法
最近幾年，毛囊干細(xì)胞以其強(qiáng)大分化能力被認(rèn)為是即神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞之后的又一真正干細(xì)胞。它來(lái)源廣泛，不像其他細(xì)胞那樣難以取得，因此被認(rèn)為是可以大量利用的干細(xì)胞。然而毛囊干細(xì)胞的分離卻成為其中的一大難題。
對(duì)毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)進(jìn)行討論。 使其規(guī)范，以后手術(shù)時(shí)就輕松自如的調(diào)整焦點(diǎn)。
我們實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)大鼠觸須的毛囊干細(xì)胞一般用組織塊法，也有用消化法的，組織塊法一般是在體視顯微鏡下將毛囊先從組織中分出，然后消化，將真皮鞘剝掉，分離出完整的毛囊，但要主要bulge區(qū)一定保持完整，然后接種培養(yǎng)，一般都能養(yǎng)的出來(lái)．

手術(shù)顯微鏡的調(diào)整:
使用手術(shù)顯微鏡前需對(duì)手術(shù)顯微鏡進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其在手術(shù)過(guò)程中始終處于最佳工作
狀態(tài)。應(yīng)形成程序化，其具體步驟如下：
1. 0位調(diào)整即將X-Y軸及聚焦微調(diào)系統(tǒng)均調(diào)整到0位。先將X-Y軸0位調(diào)整按鈕，使顯微鏡自動(dòng)運(yùn)行到中心起始位置，使術(shù)中通過(guò)X-Y軸系統(tǒng)調(diào)整時(shí)，鏡頭向各方向移動(dòng)有充分的余地。然后將聚焦微調(diào)系統(tǒng)調(diào)至0位，這樣可以使術(shù)中聚焦微調(diào)有足夠的升降調(diào)節(jié)范圍。
2.調(diào)節(jié)目鏡的屈光度以矯正術(shù)者的屈光不正，如無(wú)屈光不正，目鏡應(yīng)在0位，需
雙眼分別進(jìn)行調(diào)整。若屈光不正大于5D或有散光時(shí)，術(shù)者應(yīng)戴矯正眼鏡。用低倍鏡聚焦于虹膜表面或角膜緣附近小血管，至看得非常清晰為止。術(shù)者調(diào)整后，在同一條件下助手按同樣步驟調(diào)整目鏡的屈光度，也能看清同一目標(biāo)。
3.調(diào)整瞳孔距離雙眼同時(shí)觀察畫(huà)面，若其中一側(cè)不在視野中心，應(yīng)調(diào)整瞳孔距
離旋扭，直至獲得雙眼立體視覺(jué)效果。
4.調(diào)到高倍鏡，如200×，反復(fù)聚焦調(diào)節(jié)，直到能清晰看到虹膜紋理，且瞳孔在中
心位置。然后再調(diào)回到低倍鏡，備用。
5.進(jìn)行白內(nèi)障摘出人工晶狀體植入手術(shù)時(shí)，應(yīng)注意調(diào)整顯微鏡物鏡的傾斜度及患
者的頭位，使目鏡平面與患者術(shù)眼的平面基本平行，以產(chǎn)生良好的紅光反射。
6.倍率調(diào)節(jié)放大倍率是手術(shù)顯微鏡的一個(gè)重要參數(shù)，放大倍數(shù)不同，可見(jiàn)視場(chǎng)直徑大小及景深也不同。放大倍率越小，視野所及范圍越大，反之放大倍率高，則視野范圍小。4×放大倍率，視場(chǎng)可包括所有眼瞼、上及眉弓下到顴突，即視場(chǎng)直徑約為50mm；8×視場(chǎng)可包括內(nèi)外眥部，約’30mm直徑范圍；10×視場(chǎng)可包括整個(gè)眼球，即開(kāi)瞼時(shí)所有結(jié)膜暴露部分，約22mm直徑范圍；20×視場(chǎng)恰好包括整個(gè)角膜,約11mm直徑范圍；而25×視場(chǎng)僅包括虹膜中周部以內(nèi)，約7mm直徑范圍。對(duì)以上不同倍率所及范圍應(yīng)有明確概念，以便在手術(shù)中根據(jù)手術(shù)部位和操作步驟作隨意調(diào)整。
在手術(shù)顯微鏡的應(yīng)用中，放大倍率越高，視野越窄，景深越小，操作也越困難。特
別是對(duì)初學(xué)者，高倍率下常感困難。一般而言，低倍鏡下不適于涉及范圍大或動(dòng)作幅度較大的操作，如剪開(kāi)結(jié)膜結(jié)扎縫線等用4×-6×比較合適，而一些精細(xì)操作如截囊、小梁切除，用10×-12×較為安全，作小梁切開(kāi)辨認(rèn)sehlemm管時(shí)可用20×-25×。
7.如有教學(xué)鏡及攝像錄像設(shè)備，手術(shù)前同樣進(jìn)行同步視度調(diào)整，以取得最佳示教
效果。
8.術(shù)中調(diào)整顯微鏡
（1）在不同層次操作時(shí)，應(yīng)及時(shí)調(diào)整顯微鏡的焦距，使焦點(diǎn)準(zhǔn)確地落在正進(jìn)行手術(shù)操作的組織上，使手術(shù)始終在最清晰的情況下進(jìn)行。
（2）根據(jù)手術(shù)組織的大小不同，及時(shí)調(diào)整顯微鏡的放大倍率。
（3）根據(jù)手術(shù)需要調(diào)節(jié)顯微鏡的傾斜度，如沖吸晶狀體皮質(zhì)時(shí)，為獲得最佳的紅光反射，應(yīng)將顯微鏡的光線垂直射入眼底，不需要紅光反射下操作時(shí)，應(yīng)及時(shí)改變顯微鏡的傾斜度，避免顯微鏡垂直射入眼底而損傷黃斑。
我覺(jué)得分離大鼠胡須的毛囊來(lái)培養(yǎng)還是比較容易的，但我不能確定養(yǎng)不出來(lái)的細(xì)胞是不是毛囊干細(xì)胞
討論：
因?yàn)椴恢�道你想分離的是哪種細(xì)胞，是內(nèi)皮還是黑色素還是提到的新的干細(xì)胞，文中的分離步驟可大致總結(jié)為
1 采集人頭皮組織(0.5 X 2cm2 ),洗凈，切斷，去除多余脂肪組織
2 酶消化24h in 4C(dispase in DMEM Invitrogen)使上皮從真皮層脫落‘
3 把毛囊從真皮層剝離出來(lái)，用PBS洗滌，完全去除真皮和上皮的污染
4 0.25% Trypsin/EDTA消化37C 30min
5 40um BD strainer過(guò)濾 接種
6 培基條件 標(biāo)準(zhǔn)ES培基（80% KO DMEM 20%FBS 200mM Glutamine,0.1 Beta-巰，1% Non-AA, 4ng/ml bFGF)先與MEF培養(yǎng)48h，收集條件培養(yǎng)液后與新鮮ES培基3:1混合，過(guò)濾，再加4ng/ml bFGF)

在上面的原代培養(yǎng)中，用ES培基即能誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞的出現(xiàn)（human follicle stem cell),接下來(lái)的單克隆實(shí)驗(yàn)（極限稀釋法）表明毛囊干細(xì)胞的自我增殖特點(diǎn)，并能重新形成hair sphere,這些毛囊干細(xì)胞不表達(dá)常規(guī)的黑色素干細(xì)胞標(biāo)記MITF和TRYP1,神經(jīng)元的MAP2和b微管蛋白，平滑肌中的calponin and desmin，還有角質(zhì)細(xì)胞的角蛋白等，但表達(dá)Oct-4和nanog.但有說(shuō)服力是，在后續(xù)的誘導(dǎo)條件下，這些不再表達(dá)的基因又重新出現(xiàn)，沒(méi)有誘導(dǎo)則不出現(xiàn)。推廣到我們目前研究的多的MSC，成體干細(xì)胞真的也具有多能性嗎？是一種轉(zhuǎn)分化機(jī)制（受周圍環(huán)境誘導(dǎo)的直接譜系轉(zhuǎn)化）還是一種先去分化再分化的途徑？我記得以前在nature上看到一篇關(guān)于果蠅生殖干細(xì)胞的研究中，在28C分化，回到19C后，分化的干細(xì)胞又變成了干細(xì)胞，說(shuō)明環(huán)境因素也能參與干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)調(diào)控，現(xiàn)在的情況是越來(lái)越不清楚了。當(dāng)然這篇文章只是提到了新發(fā)現(xiàn)的一種干細(xì)胞，從描述上看似乎比成體干細(xì)胞更幼稚（有更強(qiáng)的分化能力），介于于ES-Adult stem cell之間，或者是一種更原始的前體細(xì)胞，又或者是已證明存在的黑色素和內(nèi)皮干細(xì)胞的干細(xì)胞池，究竟干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)要外延多遠(yuǎn)，拭目以待。